la PCR

L'altre dia, en un post sobre identificació de cossos mitjançant ADN, vaig parlar de la PCR, una tècnica per obtenir moltes còpies d'un fragment determinat d'ADN, o dit d'una altra manera, d'amplificar-lo. Quan la Laia em va preguntar per què servia tenir tantes còpies, vaig pensar que seria una bona idea fer algunes entrades dedicades a tècniques de laboratori.

En un laboratori de genètica, una vegada obtingut l'ADN, el primer que normalment es fa és la PCR, la Reacció en Cadena de la Polimerasa. Això és així per dos motius principals. En primer lloc, no volem pas analitzar tot l'ADN, sinó només un fragment (bé, això comença a no ser ben bé veritat, però ho deixarem per un altre dia i de moment ens centrarem en les tècniques clàssiques). I en segon lloc, els processos que realment ens interessen, com la identificació d'STRs o la seqüenciació, necessiten molts quantitat d'ADN per funcionar. De fet, la PCR no és un fi en si mateixa, sinó un mitjà per realitzar les proves que necessitem.

La PCR és relativament moderna, la va inventar en Kary Mullis el 1983. Per impossible que sembli ara, la majoria de professors a la facultat va començar les seves carreres sense ella! De fet, una de les coses que ho va fer possible va ser el descobriment del bacteri Thermus aquaticus el 1969, de qui possiblement en parlaré un altre dia. La gràcia d'aquest bacteri és que viu en fonts termals, a uns 70º C, i per tant la seva maquinària cel·lular està adaptada a altes temperatures. Per fer la PCR utilitzem una de les seves eines de duplicació de l'ADN, un enzim que en honor seu ha estat anomenat Taq polimerasa.

Però, com funciona la PCR? Bé, en primer lloc hem de posar en un tubet l'ADN juntament amb una barreja que contingui Taq polimerasa, primers (encebadors en català), els nucleòtids i clorur de magnesi. Els primers o encebadors són seqüencies complementàries a les zones que flanquegen la regió d'ADN que volem amplificar. I els nucleòtids són les famoses A, T, C i Gs, amb les que farem les noves cadenes d'ADN.

A continuació ja es pot posar aquesta barreja al termociclador -la màquina de la foto de l'inici del post-, que és l'encarregada de dur a terme la PCR, i programar les condicions adequades. Segons la regió que es vol amplificar les condicions són una mica diferents, però es poden distingir tres passos fonamentals:

1. Separar les dues cadenes d'ADN. Això es fa a uns 94-96º, ja que a aquesta temperatura l'ADN no pot mantenir la seva estructura.

2. Unir els primers o encebadors amb la cadena d'ADN, posant la barreja entre 50 i 65º.

3. Fer les noves cadenes d'ADN. Aquest darrer pas es du a terme a uns 72º, la temperatura idònia per què la Taq polimerasa es posi a treballar unint nucleòtids a les noves cadenes.

clicar per veure l'animació

Aquests tres passos es duen a terme moltes vegades, normalment entre 30 i 50, i al final es calcula que s'obtenen uns mil milions de molècules d'ADN. Finalment es fa un cicle d'entre 5 i 15 minuts per acabar de formar cadenes noves, i quan ha acabat el termociclador es posa a entre 4 i 15º, la temperatura a què les mostres es conserven, fins que l'investigador va a treure-les.

Un cop fet això, només queda comprovar que la PCR ha funcionat i seguir endavant amb la feina! Tot això, però, serà tema d'un altre post...

Nota: l'animació l'he tret d'aquí. En podeu trobar de més bones en flash aquí (més explicativa, en shockwave) i aquí (més visual, en flash).